独自生活时能将分子态氮还原成氨、氮，行营养自给的细菌类群。它们也是自然界化合态氮的主要提供者。自维诺格拉斯基（S.N.Winog-radsky）于1893年最早分离出嫌气自生固氮菌——巴斯德梭菌（Clostridium pasteurianum）以来，已发现和确证具有自生固氮作用的细菌近70属，分属真细菌和蓝细菌两大类，按营养型不同，分为异养型和自养型。

以有机物为碳源和能源，利用分子态氮或环境中的氮化物为氮源，合成细胞物质。按其对氧的要求又可分为：

发现较早，分布广泛，且研究较多，常见的有4个属，在伯杰氏鉴定细菌学手册，第8版（1974）中均属固氮菌科（Azotobacteraceae）。但在伯杰氏系统细菌学手册第9版（1989）中，詹耀增根据rRNA顺反子分析和数值分类，认为拜叶林克菌属和德克斯菌属与固氮菌属和氮单胞菌属关系较远，故在固氮菌科中仅保留后两属，而前两属则未确定其分类地位。这群固氮菌严格需氧，通过加强呼吸和固氮酶变构方式，对固氮酶进行防氧保护，在培养基中每消耗1克糖固定氮素10毫克左右。在低氧分压条件下生长并固氮的好气固氮菌中，较重要的有固氮螺菌属（Azospirillum）；另外，在甲基营养菌中发现有几个属，如甲基杆菌属（Methylobacterium）、甲基弯菌属（Methylosinus）等也有固氮能力。

好气自生固氮菌属的特征

包括肠杆菌科（Enteroba-cteriaceae）中的一些属、种和芽孢杆菌属（Bacillus）中的少数种。它们在有氧和缺氧条件下都能生长，但只有在缺氧或低氧分压条件下固氮。已证明能固氮的肠杆菌有：肺炎克氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）、阴沟克氏杆菌（K.cloacae）、中间埃希氏菌（Escherichia intermedia）等。在研究固氮菌的生化及遗传的一些基本理论问题中，曾广泛应用肺炎克氏杆菌为材料，它的固氮基因首先被转移到某些不固氮的细菌。这类肠杆菌分布比较广泛，存在于土壤、植物根际、水域及人畜肠道中，曾从白蚁后肠中分离到这类固氮菌，它们还与许多禾本科植物根系联合固氮。

这一群包括丁酸发酵型的梭状芽孢杆菌，最重要的有巴斯德梭菌，是较大的杆菌0.5～0.8×3.4～13.2微米，能利用各种有机化合物作为能源和碳源，在pH4.5～9.0的范围内都能生长，因而广泛分布在各种土壤中，耕地土壤中的数量为每克土10²～10⁵个，有时可多达10⁶个，但固氮效率比好气自生固氮菌低，每消耗消1克糖只能固定2～10毫克氮，此外，还有一些硫酸还原细菌也具有固氮作用，如去硫脱硫弧菌（Desulfovibrio desulfuricans）、普通脱硫弧菌（D.vulgaris）和巨大脱硫弧菌（D.gigas），以及瘤胃脱硫肠状菌（Desulfotomaculum ruminis）和东方脱硫肠状菌（D.orientis）。

主要为光合型自生固氮菌，利用日光能固定CO₂和大气中的N₂以合成自身细胞。光合细菌中能固氮的有蓝细菌（Cyanobacterium）、红螺菌科（Rhodospirillaccae）、着色菌科（Chromatiaceae）和绿菌科（Chlorobiaceae）的一些属、种。蓝细菌中能固氮的已记载了30多个属，其中分布最广，固氮作用最强的有鱼腥藻属（Anabaena）和念珠藻属（Nostoc）等，大多数是有异形胞的多细胞丝状蓝藻。异形胞具厚壁，只有光合系统Ⅰ，不能固定CO₂，不产生O₂，但能产生ATP是固氮酶固氮的场所，有小孔与营养细胞相通，营养细胞只在无氧条件下才有固氮酶活性。60年代末先后发现单细胞蓝藻——粘杆藻属（Gloeothece）在有氧条件下能够固氮，鲍氏织线藻（Plectonema boryanum）在微氧条件下固氮；后又证明鞘丝藻属（Lyngbya）在缺氧条件下也能固氮。蓝细菌分布广泛，在水稻田中旺盛生长，可提供水稻的氮营养；在极地占优势的固氮菌是念珠藻及与其共生的地衣；干旱沙漠地带或火山爆发后的火山土中，蓝细菌和与其共生的地衣是先锋生物，是土壤有机质最早的积累者。它们也生活在水体表层，是海水和淡水中的主要固氮生物，估计蓝细菌的年固氮量在每公顷75千克以上。红螺菌科、着色菌科和绿菌科的许多种都是在有光照的嫌气生活条件下固氮，广泛分布在浅海的淤泥表面、污染的水圹或硫磺泉中，有H₂S、CO₂及N₂的地方，尤其在夏季生长最为繁盛。对它们的固氮力未做估计。

固氮作用是一个耗能较大的过程，自养型固氮菌可以自己制造碳水化合物，为固氮作用提供能源和碳源，而异养型固氮菌则只有当环境中含丰富的有机碳化物和缺少化合态氮时，才能旺盛地进行固氮作用。如果土壤中含丰富有效的化合态氮，一方面，固氮菌将利用这些化合态氮作为氮源，固氮作用受到抑制；另一方面，非固氮微生物由于氮源充足，容易繁育，进而同固氮菌竞争碳源。因此，只有在土壤有机质的C/N很高的情况下，才能发挥自生固氮菌的固氮作用。同时，自生固氮菌所固定的氮很少分泌到体外供作物利用，只有当细胞死亡、分解后，固定的氮才能全部释出。所以，一般土壤中靠自生固氮菌积累的氮是有限的。在植物根际，由于根的分泌物、脱落物提供了碳源和能源，可刺激自生固氮菌生长繁殖；农田土壤中施用大量有机肥料或秸秆还田时，也可刺激自生固氮菌的生长繁殖，从而丰富了土壤氮。