以胶体状态的金微粒标记抗体、葡萄球菌A蛋白(SPA)或大分子抗原进行免疫定位和测定的技术。胶体金是一种带负电荷的疏水溶胶,可以制成一定大小的分散粒子。在一定条件下,这些金颗粒可通过静电吸附与蛋白质等大分子物质结合,而不影响结合物的生物活性。因此,可用以替代酶和铁蛋白等,作细胞水平或亚细胞水平的抗原定位
以胶体状态的金微粒标记抗体、葡萄球菌A蛋白(SPA)或大分子抗原进行免疫定位和测定的技术。胶体金是一种带负电荷的疏水溶胶,可以制成一定大小的分散粒子。在一定条件下,这些金颗粒可通过静电吸附与蛋白质等大分子物质结合,而不影响结合物的生物活性。因此,可用以替代酶和铁蛋白等,作细胞水平或亚细胞水平的抗原定位,也可用作免疫检测。
氯金酸〔H(AuCl4)4H2O〕水溶液在还原剂作用下,可还原成粒子大小不同的胶体金溶液。最常用的还原剂是柠檬酸钠,它是一种电解质,加入氯金酸溶液后,可改变溶液的电抗,导致金粒子集结,使原来的真溶液变为胶体金溶液。柠檬酸钠浓度愈低,所形成的金粒子愈大。因此可通过改变柠檬酸钠的用量来控制金粒子大小。
取4%氯金酸贮备液0.5毫升,加于200毫升双蒸馏水中,煮沸后加入一定量1%柠檬酸钠溶液,迅速混合,继续加热5分钟,溶液呈红葡萄酒色即成。1%柠檬酸钠用量与金粒子大小的关系为:8毫升—15纳米,6毫升—20纳米,3.5毫升—40纳米。金粒子的大小可在电子显微镜下测定。
将提纯抗体调整到1毫克/毫升,在pH9.0 2毫摩尔/升的硼酸缓冲液中透析,用前离心澄清。抗体溶液与胶体金的比例视金粒大小而定,粒子愈小,需要抗体量愈大。15纳米以下粒子按1∶2比例,20纳米和40纳米粒子可按1∶3~1∶5比例混合,最适比例应实测后确定。二者按最适比混合作用1分钟,加入用氢氧化钠调整至pH9.0的10%牛血清白蛋白溶液,使其最终含量为1%,经离心洗涤后,加叠氮钠作防腐剂,即成免疫球蛋白—金溶液—胶体金抗体复合物。该溶液应呈红色或橙色,如变为紫蓝色,表示反应中抗体量不足。制备时所用的最适pH值与抗体的等电点大致相同,如用单克隆抗体时,最好先用等电聚焦测定其等电点后,再确定标记时所用pH值。
与其他免疫组化法相似,有直接法、间接法和搭桥法等。后者多用于光学显微镜检查,前者用于电学显微镜水平检测,细胞着色部位在光学显微镜下呈红色,在电学显微镜下则可直接见到金粒子,可根据着色和金粒子的分布,确定抗原所在部位。
在IGS法的基础上,使银粒子沉着于抗原所在部位的金粒子周围,使反差加强以便于用光学显微镜检查。标本片经IGS法处理后,在暗室中,将其放入显影罐中,加入显影液,使显影液中的银离子还原析出,吸附于金粒子上,经复染后,即可用于光学显微镜检查,抗原所在部位呈黑色。
胶体金能直接包被蛋白质抗原或抗体,包被后的复合物呈红色或橙色,抗原抗体反应后出现微小凝集,则变为无色。因此可根据肉眼观察或分光光度计测定以判定结果。
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