将供体母畜配种后形成的早期胚胎取出并移植到受体母畜体内,使之发育成新个体的繁殖技术。哺乳动物最早的胚胎移植试验是英国学者希普(W.Heape)于1890年用兔子试验成功的,家畜的胚胎移植最早是于20世纪30年代用绵羊、山羊进行的,从此胚胎移植技术显示了对畜牧生产和育种的重要意义和应用前景。1951年相继报道了牛、猪的胚胎移植成功,1970年马的胚胎移植有了试验结果。
将供体母畜配种后形成的早期胚胎取出并移植到受体母畜体内,使之发育成新个体的繁殖技术。哺乳动物最早的胚胎移植试验是英国学者希普(W.Heape)于1890年用兔子试验成功的,家畜的胚胎移植最早是于20世纪30年代用绵羊、山羊进行的,从此胚胎移植技术显示了对畜牧生产和育种的重要意义和应用前景。1951年相继报道了牛、猪的胚胎移植成功,1970年马的胚胎移植有了试验结果。70年代以后,胚胎移植技术才发展到在畜牧生产中实际应用阶段,特别是牛的胚胎移植,发展很快,目前在许多发达国家中都建立了牛胚胎移植的商业机构。中国自60年代以来,尤其是70年代以后,先后在兔、绵羊、牛、马、山羊等试验成功,在操作技术方面,基本已跟上国际步伐,在胚胎分割、经性别鉴定胚胎的保存和移植、卵母细胞体外培养和受精、早期胚胎细胞核移植等,均已取得一些成果。
近50年来,通过人工授精技术大大提高了优良种公畜的利用率和配种效果。但对优良母畜的繁殖潜力,未得到充分的发挥,胚胎移植技术为提高优良母畜的繁殖效力开辟了有效途径。例如在自然情况下,一头母牛和母羊通常一年只能产一犊或两羔,而通过超数排卵处理,它们却能够产生10倍或数十倍的早期胚胎。而通过移植到一般的受体(胚胎养母),就可能获得10倍或数十倍优良后代。
例如在一个畜群中,最优良的高产母畜个体,只占少数,如能通过胚胎移植使这个畜群中的一般中、低产个体,代培高产供体的胚胎而产生优良母体的后代,无疑地可加速品种改良而扩大良种畜群。
在肉牛生产中,双胎可增产,在自然情况下肉牛产双犊的机会不多,如能给已配种的母牛在排卵卵巢对侧子宫角中,移植一枚胚胎,这样不但可以提高受体母牛受胎的机会,同时也增加了产双胎的机会。此外,如利用土种母牛生产良种肉牛,还可以向受体牛移入两个胚胎。这种胚胎移植的方法,已形成一种肉牛生产的方式。
冷冻胚胎可长期保存,使移植不受时间和空间的限制。胚胎运输方便,大大节约了运输费用。此外,良种胚胎成本远远低于良种牲畜个体,而且易于购得。
长期保存某些特有的家畜的品种和动物种质资源,是耗资很大的一项工作,如通过保存胚胎,建立基因库和应用移植技术,则可使此项工作较易实现。
如培养无特异病原(SPF)畜群采用胚胎移植,比采用传统的剖腹产方法更为有效。
胚胎移植的程序
母畜应具有较高的育种价值,生殖机能正常,一般处于产后两个月以上,经证实对超数排卵有较好的效果。对受体母畜应要求体质良好体型中上等,有较好的繁殖性能。如移植鲜胚,一头供体应准备数头受体,两者发情时间相同或接近,前后不超过一天,如有条件选择与供体同时自然发情的受体母畜,最为理想,否则须通过同期发情处理,以获得足够数量的受体。
使供体母畜产生最大数量的优质胚胎,才能充分发挥胚胎移植的最大效益。在供体母畜发情周期的适当时间,通过注射外源促性腺激素,使卵巢中有比自然发情时较多的卵泡发育并排卵。经过超数排卵的母畜,在表现发情时,根据需要用良种精液进行适时输精2~3次,间隔时间为8~10小时。
一般在配种后当胚胎发育至4~8细胞以上时收集为宜,牛最好在6~8日胚胎发育至桑椹胚晚期或囊胚早期时收集和移植。各种家畜的排卵时间和胚胎发育速度见表1。
表1 各种家畜排卵时间和胚胎发育速度
收集胚胎有手术法和非手术法两种。前者适于各种家畜,后者仅适于牛、马等大家畜,且只能在胚胎进入子宫角时才能收集。手术法需按照外科手术的要求切开腹部,用注射器吸取冲洗液冲洗输卵管或子宫角。冲洗部位决定于冲洗时胚胎运行到达的位置(图1)。
图1 手术法冲洗胚胎
冲洗操作要求迅速准确,防止污染,避免过多地刺激或造成损伤。不能反复多次使用同一供体,要求外科手术熟练。术后生殖道易发生粘连,严重时会造成不孕,这是手术法的严重缺点。对牛、马等大型供体进行非手术法收集胚胎时,以牛为例,须在配种后6~8日进行,借直肠把握方法将二路式冲卵导管送到子宫角内,使外管前端气囊充气,堵住一侧子宫角后端,再将冲洗液通过内管注入子宫角内,然后再导出冲洗液或用三路式导管循环冲洗(图2)。每侧子宫角需用冲洗液100~500毫升。应尽量收回全部注入的冲洗液。目前常用的胚胎冲洗液有:杜氏磷酸缓冲液(PBS)、布林斯特液(Brinster′s medium-3)、合成输卵管液(SOF)、惠滕氏液(Whitten′s medium)、哈姆氏液(Ham′s F-10)及199组织培养液(TCM 199)。这些不但用于冲洗收集胚胎,还可用于体外培养、冷冻保存和解冻胚胎,其主要成分见表2。收集胚胎冲洗液可不含牛血清蛋白,但检查增养和保存时则须加入,或以胎犊血清代替。
图2 母牛非手术法收集胚胎示意图
表2 几种常用胚胎培养液的成分(mg/ml)
收集到的冲洗液,经静置沉淀后,移去上层液体,或经过滤装置,移去滤液,在解剖镜下检查胚胎数量和发育情况。确定发育正常者,用于移植或进行保存。正常发育的胚胎,一般形态整齐,卵裂球清晰,分布均匀紧密,发育速度与胚胎日龄一致。胚胎形态异常及停止发育者,应予以淘汰。
胚胎保存对胚胎移植的实用价值非常重要。在上述培养液中,于室温条件下,胚胎只能存活10~20小时。温度降至20℃以下,胚胎即停止发育,存活时间可延长,如牛、羊胚胎在5~10℃可存活数日,桑椹胚和囊胚比更早期的胚胎较耐低温易于保存。猪胚胎对低温较敏感,不易保存,胚胎在体温条件下培养(37℃),试验研究证明一部分可正常发育,一般只能持续3~4天。利用活体兔输卵管保存胚胎,在牛、猪、羊、马中都获得成功,但须进行两次冲胚才能移植,显然影响其实用价值。冷冻长期保存家畜胚胎也在牛、绵羊、山羊中应用。胚胎冷冻保存时,须在培养液中加添防冻保护剂甘油或二甲基亚砜(DMSO)。冷冻前须依次经过含有低浓度到高浓度防冻剂的培养液,最后缓慢地由室温降至-5~-7℃时,进行诱发结冰,再按每分钟0.3~0.5℃的速度降至-33~-38℃,投入液氮保存,解冻时可直接在20~25℃室温或35~37℃水浴中解冻,解冻后必须逐次除去培养液的防冻剂,然后用于移植。
有手术法和非手术法两种。后者仅适用于牛、马等大型家畜。采用手术法时,在受体腹部切开,找到排卵侧卵巢。用注射器或移植管将胚胎移至同侧子宫角上沿或输卵管壶腹部,须根据胚胎发育阶段而定。如给牛、羊移植两个胚胎时,应每侧移一个。因猪可自动调整将胚胎均匀转移到两个子宫角中,猪的胚胎可全部移到一侧子宫角内。非手术移植法,大致与直肠把握输精法相同,即将移植管插入排卵侧子宫角内,注入胚胎。
胚胎移植的效果首先决定于胚胎来源,目前仍依赖于供体超数排卵可能获得的有效胚胎数,这又取决于排卵率、收集率和受精率,而移植成功率又决定于操作技术水平和供体受体发情同期化的程度。为扩大胚胎来源,卵巢卵母细胞的体外培养、成熟和体外受精的应用,早期胚胎性别鉴定及长期保存的有效利用,均为胚胎移植在畜牧生产中的实际应用开辟了道路。
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