独自生活在土壤、水域或培养基中与其他生物无依存关系的一类原核生物将分子态氮还原为氨的过程。自生固氮微生物种类很多，分散在细菌和蓝细菌的不同科、属和生理群中，波斯特盖特（J.R.Postgate，1982）列举了能固氮的37个细菌属和20个蓝细菌属。已发现和确证具有自生固氮作用的原核生物近70属。农业上发挥自生固氮作用与环境条件有密切关系。固氮微生物的正常生长是发挥固氮作用的前提，但它们所需要的良好生活环境不一定就是进行固氮的适宜条件。生长和固氮有许多共同条件，但有的条件对生长有利，却对固氮不利；也有些条件对固氮有利，对生长则不利。C/N比和氧往往是影响自生固氮作用的重要因素。

光能营养固氮微生物自己可合成碳水化合物为固氮作用提供碳源和能源。化能异养固氮微生物只有当环境中有丰富的碳水化合物和缺少化合态氮时才能进行旺盛的固氮作用。土壤中如果化合态氮丰富，一方面，固氮微生物利用现成的氮化物作为氮源，固氮机能受到抑制；另方面，非固氮微生物由于氮源丰富大量增殖，同固氮微生物竞争碳源和其他养分。因此只有在C/N比很高的情况下，化能异养固氮微生物才能发挥作用。试验证明当土壤中C/N比下降到低于70～40∶1时，固氮作用迅速停止。据计算，自生固氮菌固定100千克氮，约需消耗有机碳化物10000千克。在适宜的pH条件下，一般每克土壤约有固氮菌（Azotobacter）10³～10⁴个，固氮梭菌（Clostridium Pasteurianum）约10³～10⁵个，这对氮素累积的作用不大。当其他条件适宜，并加入大量可给态有机碳化物以提高C/N比，使固氮菌的数量达到每克土含10⁶～10⁸个时，每消耗1克碳化物可固氮5～10毫克。因此除非土壤中有大量可给态C/N比高的有机物，否则异养自生固氮菌不可能发挥作用。

固氮酶容易被氧钝化，所以它的催化作用只能在无氧条件下进行。对于严格嫌气固氮菌，生活条件和固氮条件是一致的。兼性嫌气固氮菌一般只在无氧条件下固氮，而好气固氮菌在有氧条件下才能生长繁殖，这同体内固氮酶催化作用的条件形成尖锐矛盾。各种好气固氮菌在进化过程中发展了不同类型的防氧保护机制，实际上它们也只有在低氧分压下才能旺盛生长和固氮。降低氧气供应有利于土壤中的自生固氮作用，通常是在pO₂为0.04时活性最高。

利用自生固氮菌（Azotobacter）制备细菌肥料进行大量试验，对各种作物的增产效果不一致，一部分试验结果平均增产5%～10%，但也有不增产的。对于增产的解释也有认为不是由于固氮作用，而是固氮菌产生植物生长刺激素或对病原菌的抑制作用，并证明自生固氮菌能合成赤霉素、细胞激动素和吲哚乙酸。自养型自生固氮微生物已被重视，因为它们的碳源和能源较易解决。如固氮蓝细菌所需的光能、CO₂和水热条件，在南方水稻田中都能得到满足。管链藻、眉藻、筒孢藻、念珠藻和单歧藻等属蓝细菌和一些种已用作接种剂，对水稻有增产效果。中国科学院武汉水生生物研究所多年田间肥效对比试验表明，放养蓝细菌的稻田，稻谷增产7%～15%，平均增产10%，瘦田比肥田的增产效果更显著。蓝细菌不但通过自生固氮作用积累氮，而且增加了土壤中有机质含量。