在一定空间内呈闭锁状态存在的酶。能连续地催化反应，又可回收重复使用。

固定化酶的研究是格鲁伯霍弗（Grubhofer）和施莱斯（Schleith）在1953年开始的。他们将聚氨苯乙烯树脂重氮化，并将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶和核糖核酸酶结合固定到该树脂上。60年代后期固定化技术得到进一步发展，以色列的卡查斯基（E.Katchalski）教授及其同事研究开发了许多新的酶固定化方法，并对固定化酶的理化性质作了大量的研究。日本的千畑一郎于1969年成功地将固定化氨基酰化酶应用于D.L.-氨基酸的光学拆分上，首次实现了酶连续反应的工业化。固定化酶的出现，为酶的应用开辟了新的前景，形成了酶工程学科，是生物技术领域的重要内容之一。

酶固定化方法主要有两种：①交联法，使用双功能或多功能试剂与酶分子进行交联，在酶分子上参与反应的基团有氨基、酚基、巯基和咪唑基，最常用的交联剂是戊二醛；②载体结合法，分吸附和共价结合两种。共价结合的形式主要有重氮化、烷基化、芳香基化、戊二醛法、钛螯合法、肽键结合法、硫醇-二硫化物法；③包埋法，主要有聚丙烯酰胺凝胶、卡拉胶、大豆蛋白、微胶囊、中空纤维、辐射包埋等。

固定化对酶反应体系的影响有三方面：①物象改变和屏蔽形成；②微环境效应，由于载体的疏水、亲水及带电性质等，使紧邻固定化酶的环境区域不同于宏观体系，从而影响酶的催化能力和调节反应的能力，并使底物和效应物造成不等分布；③扩散效应，是指底物、产物和效应物在酶的微环境区与宏观体系之间迁移速度的限制。

酶固定化后，由于上述各种原因通常活力下降，但稳定性增加，又可反复多次使用，产品中没有酶的残留，因而简化了提纯工艺，适用于连续化、自动化工业生产。

固定化酶已广泛应用于工农业生产和医疗卫生、环境保护等各个领域。例如，利用固定化的氨基酰化酶、葡萄糖异构酶、青霉素酰胺酶、天门冬氨酸酶、葡萄糖淀粉酶等生产各种L-氨基酸、多果糖浆、6-氨基青霉烷酸、葡萄糖、甾体激素、3′-核苷酸、5′-核苷酸等。固定化酶可用于治疗酶缺乏症、癌症、代谢异常症以及制造人工器官等。固定化酶可制成酶试纸、酶柱、酶管、酶电极、酶热敏电阻等，用于化学分析和临床诊断。它已广泛用于工厂三废的处理、净化和回收。此外，它在阐明酶反应机制、酶亚基性质、酶结构和功能的关系等基础理论研究中也有着越来越广泛的应用。