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光学显微镜

以可见光为光源对微小物体进行放大,观察其细微结构的一种光学仪器。物体放大后的虚像,在目镜处观察,也可用光屏显示,还可拍成照片。广义的普通光学显微镜有单式和复式之分。单式显微镜即放大镜。狭义的即指复式显微镜(简称光镜)。结构由光学系统和机械系统组成(图1)。光学系统包括物镜、目镜和照明装置。 图1 复式显微镜结构模式图 物镜靠近被观察物体(标本),故又称接物镜。

以可见光为光源对微小物体进行放大,观察其细微结构的一种光学仪器。物体放大后的虚像,在目镜处观察,也可用光屏显示,还可拍成照片。广义的普通光学显微镜有单式和复式之分。单式显微镜即放大镜。狭义的即指复式显微镜(简称光镜)。

结构

由光学系统和机械系统组成(图1)。

光学系统

包括物镜、目镜和照明装置。

图1 复式显微镜结构模式图

物镜

靠近被观察物体(标本),故又称接物镜。将被观察物体进行第一次放大,是决定显微镜分辨力的关键性部件。物镜的金属外壳上,注有主要性能指标,如“10/0.25,160/0.17”,10示物镜放大倍数,0.25示镜口率,160为镜筒长度(mm),0.17为盖玻片厚度(mm)。

目镜

靠近观察者眼睛,又称接目镜。能将物镜所成的像进一步放大,但不能增加分辨力。目镜的放大倍数通常为4~16倍,在其外壳上分别注有4×,8×,10×,16×等字样。目镜直径有标准型和广视野型两种。最常用的目镜有:惠更斯目镜、兰姆斯登目镜、补偿目镜、平场目镜和摄影目镜等。

照明装置

包括聚光器、照明光源和滤光器等。

聚光器位于标本下方的聚光器架上,由聚光镜和可变光阑组成,其作用相当于一个凸透镜,使光线射入整个物镜的孔径角。聚光镜的聚光焦点,一般在上端透镜平面上方约1.25mm处,以适应载玻片标准厚度(1.1±0.04mm)。聚光镜的主要参数为镜口率,使用时应与物镜的镜口率匹配。可变光阑位于聚光镜下方,亦称虹彩光圈。由十几块金属薄片组成,可以随意调节其开孔大小,使聚光镜的镜口率适应于物镜的镜口率。通常使用时,应使聚光镜的镜口率略小于物镜的镜口率,以获得较大的反差。

照明光源可分为内、外两种类型:①外光源指天然日光、室内灯光和专门的显微镜灯;②内光源指在显微镜镜座上装备的低压卤素灯泡(特殊条件下用高压汞灯或高压氙灯),可依靠改变电压来调节照明强度。外光源利用镜座下的反射镜对光线聚焦,并将光线传送到标本上。内光源则由多个反射镜和透镜组成的聚焦系统。

滤光器位于聚光器和光源之间,为圆形有色玻片或毛玻璃片,用于消除不需要的色光或减弱光线强度,求得均匀一致。

机械系统

包括镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器和调焦装置等。

镜座

又称镜脚。是显微镜的基座,用于支持整个镜体。有的镜座内装有照明光源和反射器。

镜臂

有的固定,有的在靠镜座后侧有倾斜关节,使其可以倾斜,利于观察。镜臂用于支持镜筒、载物台、聚光器和调焦装置等。

载物台

又称镜台或标本台,用于支持标本,附着于镜臂下部,中央有一通光孔,台上装有标本片夹或带有标尺的标本移动器。载物台有固定式和移动式两种。固定式不能移动,要靠手或移动器移动标本;移动式可前后左右移动,因载物台与标本移动器连成一体。

镜筒

为金属圆筒,附着于镜臂上部,上端放置目镜,下端连接物镜转换器。为避免光线反射,筒内壁喷有黑色无光漆。目镜与物镜在同一直线上的为直式;斜式的目镜中轴与镜筒中轴成45°或60°角,光线靠折转处的棱镜转折45°或60°后仍落在目镜光轴上。安装目镜的镜筒一般有单筒和双筒之分,双筒目镜靠棱镜使光线折转和分光。从镜筒上缘到物镜转换器螺旋口下缘的距离称机械筒长。机械筒长不能变更的叫固定式镜筒,能变更的叫调节式镜筒,后者在筒上附有刻度,调节范围可在155~250mm之间。只有采用厂家所规定的机械筒长,才能发挥光学系统的最佳性能,否则会增大像差和色差。

物镜转换器

固定在镜筒下端,可装置几只不同放大倍数的物镜,可以左右转动,以便更换所需放大倍数的物镜。

调焦装置

分粗调节螺旋和细调节螺旋。用于调节物镜与标本之间的距离,以获得清晰物像。传统的调焦装置为使镜筒上下垂直移动进行调焦,粗细调节螺旋位于上下两个不同位置。近年来,也有一些显微镜则是通过载物台的上下移动进行调焦,粗细调节螺旋组成一个同轴结构位于一处。

光学原理

即透镜的成像原理。物镜和目镜的结构虽然复杂,但二者均相当于一块凸透镜。将被检物AB放在物镜(O 1)的前焦面(F 1 )之外,则在物镜上方形成一个倒立的放大实像A 1B 1,正好在目镜(O2)的焦面(F2)之内;目镜(O 2 )再对A 1B 1进一步放大而形成虚像A2B2;当眼睛在目镜上方观察时,A 2B 2通过眼睛的晶状体(O 3 )映在后方的视网膜上形成A3B3,最终使人感知显微镜放大物像的存在(图2)。

图2 复式显微镜放大原理和光路图

分辨力

又称分辨率或分辨本领。指显微镜能把两物点分开的最小距离(分辨距离)的能力。分辨距离越小,分辨力越强。分辨距离(d)与照明光的波长(λ)和物镜的镜口率(NA)的关系可用公式d=0.61λ/NA表示。若取可见光平均波长550nm为照明光波长,并使用镜口率为1.25的油镜,则其分辨距离为270nm。此值为普通光学显微镜的最大分辨力,约等于照明光波长的一半。若用可见光中波长最短的紫色光(波长约为400nm)作为照明光,则分辨距离约为200nm,此值为普通光学显微镜的分辨极限。

放大率

也称放大倍数。在标准光学筒长条件下,显微镜总放大率等于目镜和物镜放大倍数的乘积。总放大率可随光学筒长的增加和目镜放大倍数的提高而增加。但由于分辨率由照明光波长和物镜镜口率所决定,靠提高光学筒长和目镜放大倍数并不能提高显微镜的分辨率。一般有效放大率的上限是物镜的镜口率乘以1000,下限乘以250。根据这个范围,使用一种物镜,要选择与其相适应的目镜,以保证显微镜的有效放大率。如果单方面提高目镜的放大倍数超过了有效放大率的上限,即造成无效放大,不但无用,反而会降低物像的清晰度;如果降低目镜放大倍数,使总放大率低于有效放大率下限,就无法充分利用物镜的分辨本领,使显微镜的分辨率降低。例如,根据理论和技术极限,浸润系物镜最高镜口率为1.40,而干燥系最高镜口率为0.95,故光学显微镜的有效放大倍率的上限干燥系物镜为950×,浸润系物镜为1400×,若用镜口率为0.95、放大60×的物镜时,配用的目镜不得超过15×(15×60=900×);若用镜口率为1.40、放大100×的油镜时,所配用的目镜以不超过14×为宜(14×100=1400×)。

清晰度

指显微镜造成物像轮廓明显与否的能九主要取决于物镜。影响物像清晰度的因素较多,如不同色光可以造成色差、透镜本身可以造成像差、盖玻片过厚过薄、镜口率和光学筒长不合标准等都能影响物像清晰度。

应用

用于观察标本的微细形态结构,从而获得肉眼不能分辨的物体细节,如观察细胞和组织的形态结构等。生物体有的可以直接置于显微镜下观察,如观察原生动物或多细胞生物分散细胞的形态和生命活动;也可以做成合乎一定要求的标本如切片、涂片、铺片和撕片,经过染色,然后借助于显微镜进行观察;还可以结合其他学科的专门技术如细胞和组织化学技术等,对被检物作特殊处理,以便研究其化学成分及机能。在动物学植物学微生物学细胞学、组织学、胚胎学、遗传学及其他凡是需要研究显微形态结构的领域,都离不开显微镜。