测定核苷酸在核酸分子中排列次序的方法。遗传信息是以核苷酸不同的排列方式储存在DNA中，然后再通过信使RNA翻译成蛋白质，从而表现出各种生物性状。因此，DNA和RNA的核苷酸序列分析是在分子水平上研究生物的结构和功能的重要方法之一。

1965年霍利（R.W.Holley）首先测定了酵母丙氨酸tRNA的核苷酸序列（76核苷酸长），1977年分别由桑格（F.Sanger）和吉尔伯特（W.Gilbert）发明的DNA序列测定方法是核苷酸序列测定方法的重大突破。

桑格的方法称为末端终止法。在这个方法中通常把要测定的DNA片段用重组DNA技术接在病毒M13载体上，让病毒产生带待测的DNA片段的单链DNA模板。首先把模板和一段短的互补寡核苷酸（称为引物）放在一起加热，然后慢慢冷却，让模板和互补寡核苷酸结合在一起，这一步称为退火。第二步是序列测定反应。把退火好的混合物分成四份，每一份中都加入DNA聚合酶和四种脱氧核苷三磷酸（dNTP，其中一种带有放射性同位素作为标记，在图1中以dATP^*为例）。所不同的是每一份中加入的双脱氧核苷三磷酸（ddN T P）是不同的。当新生链在D N A聚合酶催化下延伸时，按照模板所规定的序列，后一个脱氧核苷三磷酸的5′-α-磷酸连接到前一个脱氧核苷酸的3′羟基上。如果在底物中含有一定比例的ddNTP，由于ddNTP缺少3′羟基，DNA链的延长就会在已掺入ddNTP的位置上停下，显然，停止的位置取决于模板的序列和用哪种ddNTP。例如用ddATP，则链终止的位置必然是相应于模板中的T的位置。由于ddATP掺入的位置是随机的，在每一个对应于T的位置上DNA链的延长反应都可能终止。因此通过这样一个反应就可以获得一组以A为末端的长短不一的片段。通过电泳，把长短不一的片段一一分开。观察片段的前后位置，就知道A在DNA中的序列。同样，用其他三种ddNTP为链终止的反应物可以确定C、G和T的位置（图1、图2）。

图1 DNA序列测定步骤示意图

图2 用末端终止法测定DNA序列的放射自显影图

吉尔伯特的方法通常称为化学降解法。把一端带有同位素标记的DNA片段在四种不同的条件下用化学试剂处理，每一种反应使得DNA片段分别在特定的碱基处断开。常用的四种反应是①G反应。用硫酸二甲酯甲基化G的3位，然后用哌啶处理，造成DNA链在G核苷处断裂；②A＋G反应。用甲酸处理可使得G和A同时从DNA链上脱落，经过哌啶处理，脱嘌呤的DNA链在G和A核苷处断开；③T＋C反应。用肼然后用哌啶处理，DNA链在T和C核苷处断裂；④C反应。当存在高浓度的氯化钠时，用上述T＋C反应，DNA链仅在C核苷处断裂。如果反应的条件选择得合适，则每种反应产生一组长短不一，但分别在特定的碱基位置断开的片段。同桑格的方法一样，把四种反应物在并列的位置上电泳，然后放射自显影，也可以直接从胶片上读出DNA的序列。

基于DNA序列测定的方法如此方便，借用DNA序列测定的同样原理，设计了若干类似的方法用来测定RNA的序列，使得RNA序列测定也取得了很大的进展。高效快速的DNA和RNA序列测定方法的建立，大大推动了分子生物学的发展。