主要指确定基因所在的染色体及其在染色体上的位置。基因定位的方法，因生物类型的特点不同而异，大致可分为染色体水平上和分子水平上的基因定位两类。

三点测验法

1911年摩尔根（T.H.Morgan）提出把交换值作为度量基因间的遗传距离。1913年斯特蒂文特（A.H.Sturtevant）首先用于果蝇的基因定位。三点测验法是用一次杂交和一次测交确定3对基因的位置。例如玉米籽粒凹陷、非糯、有色的品种（sh＋＋/sh＋＋）与饱满、糯性、无色的品种（＋w xc/＋w xc）杂交，F₁（sh＋＋/＋wxc）与隐性品种（shwxc/shwxc）测交，所得测交子代的表型（见表1）。三基因之间的交换值可计算如下：

表1 玉米的三点测验

基因定位

基因定位

基因定位

由此可知sh在三个基因中居中。wx和c的重组率21.7%，须加上双交换值2×（2＋4）/6708＝0.00178，约等于21.9%。这样可以确定三个基因在染色体上的相对位置为：

基因定位

1931年美国细胞遗传学家麦克林托克（B.McClintock）用玉米染色体缺失畸变创造了两种基因定位法。①用X射线处理纯合显性紫株（Pl Pl）的花粉诱发缺失畸变，再给绿株（pl pl）授粉，在734的F₁株中发现2株绿苗。经细胞学检查，绿株的第6染色体缺失了长臂的外段，由此可知pl基因位于第6染色体的长臂外侧。绿株是由于F₁丢失了显性基因，造成假显性现象的结果。②用隐性个体做母本，缺失杂合体做父本，缺失染色体的雄配子不能参与受精，子代表现显性的必为未交换的类型，即亲本型，表现隐性的必为重组型；如果知道缺失位点，就可对此基因进行定位。玉米和番茄的许多基因就是用上述两种方法定位的。果蝇的唾腺染色体不同节段有标记横纹，根据缺失横纹的细胞学观察和同源染色体上隐性基因的遗传表现，能够准确定出基因在染色体上的具体位置，绘出细胞学图。

缺失了一条臂的端着丝粒染色体在异源多倍体（如小麦，陆地棉）的基因定位中有特殊价值。其方法类似上述第二种。因为已知缺失位点是着丝粒，交换值表示所测基因与着丝粒的遗传距离。

非同源染色体相互易位改变了原有基因的连锁关系。利用表型遗传学鉴定和染色体易位的细胞学观察，可以确定基因或连锁群所在的染色体。例如玉米的yg₂（黄绿苗），sh（籽粒凹陷）、wx（糯性）和v₁（淡绿苗）为一连锁群；bm（叶中脉褐色）和pr（红色糊粉层）为另一连锁群。确定两个连锁群所在的染色体，一般利用一系列带标记基因的易位系进行测验。结果在对T₅（第5和第9染色体的易位）易位系的测验中，上述基因皆表现连锁；在对T_2-5易位系的测验中，只与pr基因表现连锁。yg₂、sh、wx和v ₁四个基因位于第9染色体上；b_m和Pr两个基因位于第5染色体上。同理，可以对新发现的突变基因进行易位系测验，从而确定新的突变基因所在的染色体。由于玉米染色体有清楚可辨的染色质颗粒，容易通过细胞学观察确定易位所涉及的染色体。其他生物需要通过显带技术来确定易位涉及的染色体。

利用易位系确定基因的位点。由于易位杂合体表现部分不育或半不育，可以把易位染色体的易位点看作显性基因T，把正常染色体相应位点看作隐性基因t，进行两点或三点测验。通常用具有杂合基因型的易位杂合体与隐性正常个体测交。例如玉米易位杂合体T_1-2与不同的测交种所做的儿个测交结果（表2）。

表2 玉米的易位体测验

an₁距易位点T最近，只有2.9个遗传单位，而P和lg₁距易位点T较远，分别为51.5和48.13个遗传单位。根据其他易位体的测验得知P（果皮红色）、an₁（雌穗上长雄花），f₁（细条纹叶）三个基因位于第1染色体上；lg₁（无叶舌）和v₄（淡绿苗）位于第2染色体上。因此T_1-2的遗传图为：

基因定位

用隐性个体与表现显性的一系列单体分别杂交，F₁群体均表现显性的组合，所测基因不在该单体染色体上；F₁群体中单体表现隐性，双体表现显性的组合，所测基因在该单体染色体上。

用隐性个体与表现显性的一系列三体分别杂交，F₁再与隐性亲本回交。若回交后代呈1显性、1隐性分离，所测基因不在该三体染色体上；如发生偏离，所测基因在该三体染色体上。

此外，也可用缺体确定基因所在的染色体。用非整倍体进行基因定位，特别有利于确定异源多倍体生物的异位同效基因所在的染色体。

着丝粒定位法

1932年微生物遗传学家林格伦（C.C.Lindgreen）首创。例如将粗糙脉孢霉的赖氨酸缺陷型（lys^-）与野生型（lys^＋）杂交，F₁子囊中的孢子可出现六种排列方式：＋＋＋＋----，----＋＋＋＋，＋＋--＋＋--，--＋＋--＋＋，＋＋----＋＋和--＋＋＋＋--。前两种为亲本型，是第一次分裂分离的结果；后四种是重组型，是第二次分裂分离的结果（图1）。其交换值计算为：

图1 粗糙脉孢霉交换示意

基因定位

交换值为基因距着丝粒的遗传距离。小于33.3%的为连锁，大于33.3%是独立遗传。因为在四分孢子的排列顺序中，如果“＋”排在第一位，另一个“＋”排在第二位的机会是，“-”排在第二位的机会是，后者产生重组型，即66.6%的子囊为重组型，所以最大交换值为66.6%÷2＝33.3%。

如果有两个突变基因，可进行三点的着丝粒定位。1956年豪（H.B.Howe）用粗糙脉孢霉交配型A缓慢生长（v）菌株与交配型a正常生长（v^＋）菌株杂交，子囊的分离归纳为七种类型（表3）。

表3 链孢霉的连锁遗传

基因定位

a与v位于同一染色体上的着丝粒两侧。a-v的重组率11.71%小于6.2%＋6.287%，是由于发生了双线双交换的缘故。三点的遗传图为：

基因定位

如果a、v的重组率是50%，说明不属于同一染色体。

子囊中四分孢子顺序排列的链孢霉和无顺序排列的酵母菌均适用。林德伯格用维生素B₆缺陷型（py）和维生素B₁缺陷型（th）的酵母菌py th与正常菌株py^＋ th^＋杂交，观察子代子囊孢子总数为600，其中py^＋th和py th^＋两类重组型孢子为208。重组率%＝×100%＝26%。

两种构巢曲霉品系的单倍体菌丝可联结产生异核体，偶而异核可融合成杂合的二倍体核。这种二倍体极不稳定，在有丝分裂过程中常随机的丢失染色体。经过多次有丝分裂染色体逐条丢失直至只剩下一个染色体组，而成为单倍体。如果显性基因丢失，则半合的隐性基因得以表达。两个或两个以上非等位基因在多次单倍体化过程中总是伴随在一起，即可证明这些基因位于同一条染色体上。

一个基因内部不同突变位点发生基因转变是有极性的，远端的比近端的转变频率高；位点相距愈近共转变频率愈高（见基因转变）。可以利用此特点确定基因内不同突变位点的位置。福格尔（S.Fogel）等用酵母菌四个缺陷型的杂交试验结果（见表4）。

表4 酵母菌四个精氨酸缺陷型的杂交试验

于是可以确定四个突变位点的位置为：

基因定位

并发转导法

细菌不同基因的并发转导（见转导）频率愈高遗传距离愈近，因此可以利用并发转导率进行细菌的基因定位。例如用普遍性转导噬菌体P₁侵染带有leu^＋（亮氨酸）、thr^＋（苏氨酸）和azi^r（抗叠氯化钠）三个基因的大肠杆菌作基因供体，再用释放的P₁噬菌体侵染leu^-、thr^-、azi^s菌株（受体）。将受体细菌分别进行特定培养，以便测定基因的并发转导率。如将它培养在不含叠氯化钠而加有苏氨酸的基本培养基上，于是leu成为选择的标记基因，然后对leu^＋的细胞再进一步进行选择培养，以测试它和thr^＋或azi^r的并发转导频率。同理进行其他选择标记基因的试验，结果如下（见表5）：

表5 P₁噬菌体对大肠杆菌基因的并发转导

综合三个实验的结果，可以得出三个基因的顺序为：azi—leu—thr。

由于P₁噬菌体能转导大肠杆菌二分钟图距的一段DNA，可以用下述公式计算出三点的距离。

基因定位

于是可以绘出三个基因的遗传图为：

基因定位

中断杂交法

在细菌接合中，供体（Hfr菌株）的染色体进入受体（F^-菌株）是成直线的。根据这一原理可采用中断杂交法测定供体染色体上各基因进入受体的先后顺序及时间间隔进行基因定位。将多标记的F^-菌株和Hfr菌株的细胞混合培养，每隔一定时间取少量样品进行剧烈搅拌以便中断杂交，然后在供体Hfr菌株不能生长的培养基上培养，所出现有Hfr菌株性状的菌落就是该基因进入F^-菌株的标志，进入的时间就是该基因的位点。一个时间单位（分钟）大约相当于20%的重组率。供体染色体转移的原点是F因子和染色体的接合点，由于F因子以不同方向和不同位点整合在染色体上而形成了不同的Hfr菌株。用一系列的Hfr菌株与F^-菌株进行中断杂交就可绘制细菌的遗传连锁图。目前应用中断杂交法已将大肠杆菌的约1000个基因定位在环状染色体上。

缺失定位法

多位置的突变型相当于缺失一部分染色体，也称缺失突变型。利用这些缺失突变菌株确定细菌或噬菌体的基因位置。例如确定沙门氏菌（Sal-monella）某一新的组氨酸突变型的位置，先将它与各种缺失突变型分别杂交，如果突变位点在某缺失突变型缺失染色体内，不能产生野生型重组型；如果在缺失染色体区段外，能产生野生重组型。例如，假定新突变型不能跟22、2226、2253、644、2652和2614缺失突变型产生野生重组型，而能跟其余的缺失突变型产生野生重组型，新突变的位置在组氨酸B（hisB）中（图2）。再与hisB中其他点突变杂交，可以进一步确定新突变的位点。这样不仅可以进行基因定位，还可确定基因内的不同突变位点，进行基因精细结构分析。

图2 缺失定位示意图

（见连锁与交换）。

（见分子杂交技术）。

用体细胞杂交也可以进行基因定位。例如，在离体条件下将人和小家鼠的体细胞杂交，杂种细胞在有丝分裂中会逐步丢失人的染色体。将只保留有一条或几条人的染色体的杂种细胞分别克隆，用选择性培养基培养这些杂种细胞株，可以进行基因定位。例如5-溴脱氧尿嘧啶（BUDR）能杀死含胸腺核苷激酶的细胞，而小家鼠缺少这种酶。用BUDR培养杂种株时，含有第17号人类染色体的杂种株不能存活，可以确定控制胸腺核苷激酶的基因位于第17染色体上。