DNA分子以一条核苷酸链为模板，在酶的催化下，合成另一条碱基顺序互补的单链，产生新的DNA分子。

沃森（J.D.Watson）和克里克（F.H.Crick）在发表DNA双螺旋结构模型之后，根据DNA分子两条互补链之间，腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）配对的特性，提出DNA分子是以半保留模板的方式进行复制的，即复制时碱基对之间的氢键断开，形成两条单链，各链的碱基显露。然后以每一条链为模板，在DNA聚合酶的作用下，按照碱基互补配对的原理，吸引带有互补碱基的三磷酸脱氧核糖核苷，在邻接的核苷酸间形成磷酸二酯键，合成一条新的互补链。新形成的两个子代DNA分子与亲代分子的碱基顺序完全一样，而每个子代分子的双链中都保留一条亲代DNA链，因此称作半保留复制。1958年梅塞尔森（M.Meselson）和斯塔尔（F.W.Stahl）用密度梯度离心法首次证明了DNA的半保留复制机制。大肠杆菌培养在以¹⁵N标记的氯化铵为唯一氮源的培养基中，得到¹⁵N-DNA，其密度比正常的DNA（¹⁴N-DNA）的密度约高1%；在氯化铯密度梯度离心时，这两种DNA形成位置不同的区带。他们发现，如果用普通培养基（含¹⁴N的氮源）培养¹⁵N标记的大肠杆菌，经过一代以后，全部DNA的密度都处在¹⁵N-DNA和¹⁴N-DNA之间，即形成由¹⁵N单链和¹⁴N单链组成的杂合DNA分子。两代后，则¹⁴N-DNA分子和¹⁴N～¹⁵N杂合DNA分子等量出现。若再继续培养，¹⁴N DNA分子逐渐增多。如果加热，¹⁴N～¹⁵N杂合DNA分子可分开形成¹⁴N链和¹⁵N链。在此之后，还进行了一系列的包括对细菌、动植物细胞、噬菌体和动物病毒的有关实验。采用放射自显影方法可以显示两条链局部打开的正在进行复制的DNA分子。根据放射剂量的计算表明，在子代DNA分子中有一半来自亲代分子。

在DNA复制过程中，在DNA聚合酶的作用下，总是以三磷酸脱氧核苷的5位磷酸与DNA链上3′端的3′位羟基缩合，形成3′-磷酸酯键，即DNA的复制是沿5′→3′端的方向进行的。复制时，RNA聚合酶辨认复制起点，由解链蛋白和解旋蛋白与DNA双链上的每一条链结合，促使DNA双链局部解开。每个复制点的形状像个叉子，故称作复制叉。从复制叉处起始的两条核苷酸链的合成速度和方式是不同的。其中3′→5′方向的链是先导链，以此链为模板的新DNA链的合成沿5′→3′方向连续地进行，复制速度较另一条链快。另一条链的复制却不能连续地进行。1968年日本冈崎等发现5′→3′方向的DNA复制，是先沿5′→3′方向合成不连续的DNA片段（称作冈崎片段）的方式进行的。即在复制叉处单链模板的冈崎片段起点上，由RNA聚合酶催化合成一小段（50到100个核苷酸）RNA，或结合一小段预先形成的RNA；以此RNA为引物，以DNA单链为模板沿5′→3′方向由DNA聚合酶Ⅲ或相应的DNA聚合酶催化合成冈崎片段，直到另一RNA引物的5′末端；然后在DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性作用下，水解除去RNA引物，所出现的缺口由聚合酶催化DNA片段的继续延长来填补。最后由DNA连接酶将所有的冈崎片段连接起来，成为新的DNA链（见图）。DNA复制有单向和双向复制两种。大多数生物的DNA复制为双向复制。细菌和病毒以及线粒体的DNA分子通常是作为一个复制单位（复制子）进行复制的；但是真核细胞染色体的DNA分子量很大，它们可以在许多起始点上进行双向复制，整个分子由许多复制子所组成。

DNA复制示意图

生物的遗传信息是通过DNA的复制由亲代传递给子代的。DNA半保留复制机制的特征表明，新合成的子代DNA分子准确地保存了亲代DNA分子所携带的所有遗传信息。在最适条件下，插入一个新核苷酸从而发生差错的机率低到10^-8～10^-9。这种DNA复制的准确性对于生物的繁衍，种系的延续和稳定极为重要。