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麻痹病

由病毒引起成年蜜蜂神经系统麻痹的传染病。别名瘫痪病。主要病毒有慢性麻痹病病毒、急性麻痹病病毒、慢性麻痹病伴随病毒和缓慢性麻痹病病毒。其中慢性麻痹病病毒对蜜蜂危害最大,分布最广。美国、加拿大、墨西哥、英国、法国、德国、瑞士、奥地利、意大利、保加利亚、马尔他、澳大利亚、新西兰、前苏联境内和中国发生尤为普遍。病原 麻痹病病毒属微核糖核酸病毒科,肠道病毒属。

由病毒引起成年蜜蜂神经系统麻痹的传染病。别名瘫痪病。主要病毒有慢性麻痹病病毒、急性麻痹病病毒、慢性麻痹病伴随病毒和缓慢性麻痹病病毒。其中慢性麻痹病病毒对蜜蜂危害最大,分布最广。美国、加拿大、墨西哥、英国、法国、德国、瑞士、奥地利、意大利、保加利亚、马尔他、澳大利亚、新西兰、前苏联境内和中国发生尤为普遍。

病原

麻痹病病毒属微核糖核酸病毒科,肠道病毒属。慢性麻痹病病毒(Chronic paralysis virus,简称CPV)为不等轴病毒粒子,长椭圆形,长30、40、55和65纳米,宽22纳米(图1)。英国L.贝利分离出的病毒粒子沉降系数分别为82S、97~106S、110~124S与125~136S。不同地区的慢性麻痹病病毒的沉降系数可能不同,例如美国分离出的慢性麻痹病病毒沉降系数仅为86S、96S和109S,其中长形粒子也较英国分离的病毒制剂中少得多。然而,大小不同的病毒粒子在氯化铯中的浮密度均为1.33克/毫升,血清学相同,主要蛋白质分子量为2.35×104,RNA分子量为0.35×106、0.90×106和1.35×106。病毒主要集中在病蜂的头部、蜜囊、舌腺、胸部和腹部神经节内。经纯化的病毒粒子具有很强的感染力,受感染的蜜蜂在35℃恒温下饲养五六天出现颤抖症状,失去飞翔能力,一天后死亡。

图1 慢性麻痹病病毒(×2.5×105

在感染慢性麻痹病的蜂群中常出现一种慢性麻痹病伴随病毒(Chronic paralysis virus associate,简称CPVA)。病毒为球型,直径为17纳米(图2),沉降系数为41S。在氯化铯中的浮密度为1.38克/毫升,蛋白质分子量为1.5×104,RNA分子量为0.35×106,与慢性麻痹病病毒无血清学关系,该病毒只有在慢性麻痹病毒存在的情况下才能复制,在蜜蜂体内有干扰慢性麻痹病毒增殖的作用。

图2 慢性麻痹病伴随病毒(×3×104

急性麻痹病病毒(Acute paralysis virus,简称APV)为等轴球型二十面体,直径28~30纳米(图3),沉降系数为160S,在氯化铯中的浮密度为1.37克/毫升,主要蛋白质分子量为2.3×104和3.1×104。这种病毒的许多性状与囊状幼虫病病毒相似,但两者在血清学上无关,所不同之处是急性麻痹病病毒在pH低于4时是稳定的,它的浮密度随pH值增加而增加。病毒主要积累在蜜蜂头部,特别是舌腺及脂肪体细胞的细胞质内。瓦螨与这种病毒的关系密切,它可以刺破成年蜂的体壁,将病毒刺入血淋巴,在体内复制,导致蜜蜂死亡。在夏季,蜂团温度在35℃下,积累的病毒量比在30℃下多3倍以上,而慢性麻痹病毒在30℃下增殖却比在35℃下快。

图3 急性麻痹病病毒(×2×105

缓慢性麻痹病病毒(Slow paralysis virus,简称SPV)为等轴二十面体球型病毒,直径为30纳米(图4),沉降系数为176S,在氯化铯中的浮密度为1.37克/毫升,蛋白质分子量为2.7×104、2.9×104和4.6×103,与上述3种麻痹病毒无血清学关系,病毒注射成年蜜蜂体后12天左右死亡,死亡前一两天,前两对足出现典型麻痹症状。

图4 缓慢性麻痹病病毒(×3.5×105

诊断方法

主要诊断方法有:

症状诊断

患慢性麻痹病的蜜蜂通常有两种症状,即腹部膨大型和黑蜂型。春季出现的多为腹部膨大型,行动迟缓,身体颤抖,失去飞翔能力;秋季出现的多为黑蜂型,头尾发黑,身体瘦小,颤抖。由于受健康蜂的驱逐和拖咬,病蜂多集中在巢脾框梁上、蜂箱底部和巢脾的边缘处。患急性麻痹病的蜜蜂无明显症状表现,但死亡异常迅速。

电子显微镜诊断

取一定数量的病蜂,按每只蜂体加1毫升0.01M、pH6.7的磷酸缓冲液研磨、捣碎,再加1/10体积的乙醚和四氯化碳继续乳化,经差速离心或密度梯度离心,然后将纯化的病毒液用2%的磷钨酸或醋酸双氧铀负染,置电镜下观察,若发现大量长短不一的椭圆形病毒粒子,则为慢性麻痹病病毒。若发现大量均一的球型病毒粒子,则为急性麻痹病病毒。

血清学诊断

常用的有琼脂免疫双扩散法、对流免疫电泳法、酶联免疫吸附法和双抗体夹心诊断法。在采用这些方法前,首先应制备样品和抗体。取病蜂10只置研钵内研磨,加7毫升0.01M、pH6.7的磷酸缓冲液和1.5毫升的DIECA及1.5毫升乙醚,制备悬浮液,以4000转/分的转速离心5分钟,上清液作检验用。抗体的制备是将纯化的病毒液免疫家兔,制备免疫抗体血清,可用于一般血清学诊断,如作酶联免疫吸附诊断则需进一步纯化抗体血清,获得免疫球蛋白IgG,并用酶标记后应用。三种血清学诊断法的具体操作程序分别为:①琼脂免疫双扩散诊断法。抗原和抗体在同一凝胶内彼此扩散,两者相遇后形成特异的沉淀线。将精制的琼脂粉用0.05M、pH8.6的巴比妥缓冲液配制成1.5%浓度,也可用蒸馏水或生理盐水配制。凝胶打孔为梅花型,孔径为4毫米,孔距5毫米,中间孔加麻痹病病毒抗血清,周围孔加待检测的样品,置37℃并保持一定湿度,自然扩散24小时,如出现明显的沉淀线即为阳性,无沉淀线出现为阴性。②对流免疫电泳诊断法。抗原在碱性缓冲液中带负电,在电场中向正极移动,而抗体则向负极移动,在短时间内,抗原和抗体会聚,形成沉淀线。制备琼脂板所用的缓冲液为0.025M,pH8.6的巴比妥液,电泳槽中所用的缓冲液为0.05MpH8.6的巴比妥液,琼脂板按双排或3排打孔。孔径5毫米,孔距6毫米,琼脂板两端用纱布搭桥与电泳槽中的缓冲液相连,抗体端接正极,抗原端接负极,电压5~10伏/厘米,电流强度为1~4毫安/厘米,电泳时间为30~60分钟,如出现沉淀线,可关闭电源;若不清晰,可置室温下数小时,使其继续扩散。出现沉淀线者为阳性,无沉淀线出现即为阴性。③酶联免疫吸附双抗体夹心诊断法。利用酶与抗体结合后,即不改变其免疫学反应特异性,也不影响酶本身的活性,在酶底物作用下,产生一种光学显微镜和电子显微镜下可见的不溶性反应物,揭示病毒的存在。纯化IgG抗体,抗血清经35%饱和硫酸铵沉淀,提取的丙体球蛋白用0.85%生理盐水透析至无铵离子,再经DEAE-纤维素离子交换柱层析提取IgG球蛋白,供标记用。IgG球蛋白标记采用过碘酸钠氧化法。制备辣根过氧化物酶反应溶液,4℃下对碳酸缓冲液透析,加纯化的IgG抗体,在硼氢化钠作用下与酶液反应并对磷酸盐缓冲液(PBS)透析,经饱和硫酸铵溶液沉淀3次,测定酶标记IgG抗体酶量及克分子比值。双抗体夹心诊断程序是,包被IgG抗体于聚苯乙烯塑料管或塑料板内,37℃温浴3小时,4℃冰箱内过夜,次日用吐温磷酸缓冲液洗涤3次,每次间隔3~5分钟。倾倒洗液,加待检样品液,37℃温浴3小时,用上述方法洗3次,倾倒洗液后加酶标记IgG抗体,37℃温浴3小时,在4℃下过夜,次日按上述方法洗3次,弃洗液,再加1%联大茴香胺底物溶液,37℃温浴30分钟,出现棕色者为阳性,即患病,无色者为阴性,即无病。这种方法可用于蜂场麻痹病的早期诊断。(彩图51)

防治措施

麻痹病主要通过病蜂传染,一只病蜂蜜囊内含有多达1011个病毒粒子,当蜜蜂相互接触传递食物时,健康蜂便受到感染。其次,病蜂在将采集的花粉加工成蜂粮时,病毒粒子亦随唾液腺混入其中,使其他取食蜂粮的蜜蜂受到感染。雅氏瓦螨是传播病毒的媒介。在英国,麻痹病占成年蜂病的比例较大,有的年份,成年蜂传染病的70%属于麻痹病麻痹病也是中国分布较广危害养蜂生产的一种成年蜂主要传染病,春季和秋季发生较普遍。应用核糖核酸酶防治麻痹病,具有阻抗病毒核酸合成和增殖作用。使用方法是15毫升水加50毫克核糖核酸酶,喷洒在脾和蜜蜂身上,但药物价格昂贵,不易在蜂场推广使用。通常是在健康蜂群里培育优质蜂王用以更换病群中的蜂王,增强繁殖力,壮大蜂群群势;饲喂蜂群时加入奶粉、豆粉、花粉及维生素等以补充营养,增强蜜蜂对疾病的抵抗力;杀灭和淘汰病蜂,减少传染源;将升华硫磺撒在蜂路上,可以驱杀病蜂,控制麻痹病,抑制亮热厉螨。每群每次用药5~10克,每隔7天用药1次,3次为一个防治疗程。中国农业科学院蜜蜂研究所等单位联合研制的“抗蜂病毒1号”,其主要成分为酞丁胺,对麻痹病具有显著的治疗效果和预防作用,使用浓度为100微克/毫升,每框蜂用药量为10~20毫升,隔日喷喂1次,连续防治5次为一个疗程,防治效果可达90%以上。