由病料中分离、增殖病毒的技术。由于病毒具有严格的活细胞内寄生的特性，只能在一定的活细胞内增殖，所以必须借助于实验动物培养、鸡胚培养和组织培养法来分离培养。

分离培养前，要对病料标本进行释毒和除菌处理。即用研磨、冻融或超声波裂解等方法破坏细胞释放病毒；再向释毒处理后的病料中添加抗生素（常加青霉素和链霉素）或通过除菌滤器滤过除菌。

实验动物培养

选用对所要分离培养的病毒高度易感的健康动物（体重、年龄尽可能一致。外购的动物，要了解健康、饲养及免疫情况等），使用前须经过一周以上的健康观察，常用的实验动物有小鼠、仓鼠、豚鼠、家兔、鸽、鸡、绵羊、雪貂、猴等。一些病毒具特异性，只感染易感动物，对这种病毒，只能应用易感动物进行培养。如马传染性贫血病病毒须用马，猪瘟病毒须用猪。接种途径取决于病毒的性质，诸如皮下、皮内、肌肉、腹腔、静脉、脑内等。接种后24小时内死亡的动物为非接种病毒致死，须弃掉。观察接种24小时以后的动物是否出现病态或发生死亡：检测、鉴定其器官组织内是否有病毒存在。

鸡胚培养

适于多种病毒的增殖，常用于某些病毒的分离培养、鉴定、制备抗原、生产疫苗以及某些病毒性质的研究。孵育鸡胚的受精卵必须来自健康鸡群，避免母源抗体对培养病毒的干扰。鸡胚接种途径有绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黄囊、静脉、胎儿等，可根据病毒的性质选择适宜的接种途径。接种后，置恒温箱内培养，弃掉24小时内死亡的鸡胚，用直接法或间接法观察接种24小时后鸡胚内的病毒增殖情况。直接法是观察绒毛尿囊膜上的痘疮、损伤、鸡胚生长迟缓、死亡、胎体变化等现象；间接法是用血凝、血凝抑制试验、补体结合试验等第二指示系统检测培养结果。

组织培养

包括细胞培养、组织块培养和器官培养，其中以细胞培养最常用。

细胞培养

所用的细胞类型有原代细胞、二倍体细胞株和传代细胞系。原代细胞是由动物体的新鲜组织制备培养的细胞，由多种类型细胞组成，在体外生长能力有限，很少能继代，极个别的最多只能传5～10代。二倍体细胞株是由原代细胞或继代细胞采用特殊的培养方法建立起的一种单型细胞，可经过多次传代仍保持原有双倍染色体组型，这类细胞也不能无限传代，往往传到50～100代就濒于死亡。传代细胞系是一种可以在体外无限传代的单型细胞，它们常来源于癌细胞，或由二倍体细胞株转化而来，其染色体数目不正常，称之为异倍体细胞。

原代细胞培养是先用机械方法把组织剪成碎块，再用胰酶对剪碎的组织碎块进行消化，使组织细胞间的“间质蛋白”完全水解，成为分散的单个细胞，然后再将胰酶洗掉，经吹散、细胞计数、加培养液稀释，分装后，置适宜条件下培养。在培养过程中，分散的细胞先贴壁，而后长成细胞单层。传代细胞（包括二倍体细胞株和传代细胞系）的培养过程是先将生长良好细胞层的培养瓶中的培养液倒掉，用Hanks液洗1～2次，加入胰酶消化，至细胞由瓶壁脱落时，弃去消化胰酶，加入生长液，用吸管吹打，使细胞群分散为单个细胞，再分瓶（通常一瓶分为二瓶）重新培养。分离培养病毒所选用动物细胞的种类，取决于病毒的种类和实验目的。病料的接种通常是在细胞长成良好细胞层后进行，也有在培养细胞的同时接种病毒（例如细小病毒）。接种量一般为培养液的1/10～1/20，接毒后吸附30～60分钟，倒去未吸附的多余病毒液，加入维持液，于37℃（或34～36℃）培养。接毒后，可根据细胞的变化判断病毒的增殖感染：一些病毒在细胞内增殖，可以破坏细胞，使受感染细胞出现肿胀或圆缩、聚集、死亡、细胞层破裂、脱落等病变，称致细胞病变作用（cyto pathic effect，CPE）；有的病毒在细胞内增殖不产生细胞病变，可用红细胞吸附、免疫酶标、中和试验、干扰试验、生物化学方法等检测病毒的增殖。也有的病毒在细胞内增殖产生包涵体，可助检测。

从持续性感染的材料中分离病毒，特别是潜伏状态感染的病毒，例如马立克氏病病毒，可取病变组织做体外细胞培养分离病毒，或同敏感细胞进行共同培养，观察细胞变化。

组织块培养

将适宜组织剪成适当小块，悬浮于培养液中进行培养，或将组织小块用血浆固定在瓶壁上后再加培养液进行培养，待长出新的细胞层后，接种病毒。该法由于操作和应用上的限制，现在已很少应用。

器官培养

取部分器官薄片，例如一段胎儿气管或肠管等，应用适宜的营养液加以培养，在体外成活后（可维持它原来的结构和功能达数天至数周），接种培养病毒。该法要求条件苛刻，一般很少应用。

对分离出的病毒通常采取初步鉴定和最后鉴定两个步骤。

初步鉴定

可根据需要进行下列一项或几项内容，以缩小鉴定范围。①患畜的临床症状、流行病学特点。如马属动物表现为反复发热、贫血、出血和心机障碍等症候，多为马传染性贫血病病毒感染；②分离病毒的材料；③实验动物的感染范围、潜伏期。如流行性乙型脑炎病毒小鼠脑内注射的潜伏期一般是4天，不会少于3.5～4天，如果感染后2天内死亡，可以肯定不是乙型脑炎病毒感染；④组织培养的条件、细胞病变、病毒包涵体。例如鼻病毒只能在33℃、pH7.0～7.2、较好通气（旋转培养）培养条件下才能生长，犊牛腹泻轮状病毒需用MA-104细胞培养，产生细胞病变；犊牛肠炎细小病毒需用犊牛肺、肾等原代细胞培养，出现核内包涵体；⑤病毒的生物学特性。包括凝集红细胞的性质、红细胞吸附现象、干扰现象、代谢作用等；⑥病毒的形态及理化性质。例如病毒的核酸型，病毒粒子的形态及大小、乙醚敏感性试验、耐酸性试验、红细胞受体破坏酶试验、对化学抑制物的易感性等。

最后鉴定

往往是经过初步鉴定缩小了病毒范围后，依赖血清学技术进行。主要包括：①将分离到的病毒与患畜的急性期和恢复期血清进行补体结合试验，血凝抑制试验。如果恢复期比急性期血清抗体有4倍增高，基本可以确定该病毒为病原。②将分离到的病毒与已知病毒的标准血清作中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验、放射免疫测定、酶标免疫试验。③将分离到的病毒免疫动物，制备高效价免疫血清（有的病毒对某些动物可以致死，故可用0.1%甲醛作用一定时间，使病毒灭活，再免疫动物），与标准病毒作中和试验。④用交叉保护试验来鉴定病毒。即用分离到的病毒和已知的标准病毒分别免疫动物，同时留一组健康动物作为对照，经过一段时间（一般为两周）后，用标准病毒攻击，观察其保护效果。在上述鉴定项目中，若有一两项明显阳性结果，一般即可确定该被鉴定病毒的种类，或某种疾病的病原。