兼嫌气性微生物将氮氧化物还原为含氮气体的生化过程。又称脱氮作用。产生反硝化作用的条件是：①具有代谢能力的反硝化细菌；②适宜的电子供体，如有机碳化物、还原态硫化物或分子态氢；③氮的氧化物，如、等，以作为末端电子受体；④嫌气或低的氧分压。人们早已发现硝态氮还原成气态氮从土壤中挥发损失的现象，并视之为化学过程。至1886年盖恩等（Gayen&Oupeti）于无氧条件下的试验，才确认其为生物学过程。至1895年瓦格纳（Wagner）指出，这一过程从土壤损失相当大量的氮，并认为厩肥是反硝化菌的来源。后来人们发现土壤中无处不有使硝酸盐还原的微生物。反硝化作用产生的NO、N₂O和N₂

等气体逸入大气造成肥料氮的损失，通常损失的氮占加入氮的10%～40%或以上，损失量因土壤性质、肥料种类和施肥方法而异。反硝化作用产生的NO和N₂O等上升至同温层可与臭氧结合而破坏臭氧层。以致因受紫外线直接照射，人类皮肤癌患者比例上升，植物生长受阻。反硝化作用也并不都是毫无益处的，从消除对水质的污染和减少N₂O对大气的潜在危害考虑，终产物为N₂的反硝化作用有时是必须的。要做到既避免因N₂O破坏臭氧层，又能减少浓度，保持水的可饮性，这就是反硝化作用在氮循环中具有重要生态学意义的原因。

催化反硝化作用的是菌体产生的各种还原酶。还原过程中电子经过一系列电子传递链传至硝酸还原酶，亚硝酸还原酶或N₂O还原酶，使得到还原。其生化反应过程为：

反硝化作用

由还原成为硝酸还原酶所引起；由还原成NO是亚硝酸还原酶的作用；由NO还原成N₂O是NO还原酶的作用；N₂O还原酶将N₂O还原成N₂。参与催化或还原的还原酶统称异化硝酸还原酶（DNR）或叫硝酸还原酶A，其特征随产生酶的菌和纯化方法的不同而有所不同，共同的特征是，均有很多亚单位组成的含钼、铁和不稳定的硫化物基团，估计其分子量为165000～193000，它从细胞色素b接受电子。已报道的亚硝酸还原酶，有两种类型，一种为含铜的蛋白；另一种为细胞色素c、d，它含有两个已鉴定的亚单位，每个亚单位含一个c型和一个d型血红素，分子量约为120000。它们从细胞色素c接受电子。

绝大多数化能异养菌能进行反硝化作用，但不是反硝化作用专性细菌。当氧存在时，它们以氧作为最终电子受体，进行有氧呼吸；而在缺氧时，以NO₃^-为电子受体，进行硝酸盐呼吸，使NO₃^-还原为N₂。土壤中绝大多数细菌在特定条件下均可能产生反硝化作用，主要的细菌有假单胞菌属、色杆菌属和脱硫杆菌属等。不同的菌株具有不同的反硝化酶，其末端产物各异。有的菌株只有硝酸还原酶，是其终产物；有的具有还原成N₂所需的各种还原酶；有的缺乏N₂O还原酶，N₂O是其末端产物；另一些虽具有N₂O还原酶，但不能以或为电子受体产生N₂O，还有些菌株具有异化还原成的酶活性。有的自养菌也能进行反硝化作用，如硝化硫杆菌是一种氧化硫的化能自养菌，它利用亚硫酸盐、硫磺或硫代硫酸盐为能源，将底物氧化成硫酸，将还原成N₂。