大气中的分子态氮在生物体内由固氮酶催化还原成氨的过程。自德国学者赫尔利格尔（H.Hel-lriegel）于1886年证明豆科植物根瘤具有同化分子态氮的能力以来，对生物固氮进行了大量研究。一个世纪以来，随着研究方法的改进，从整体细胞研究深入到分子学研究，对生物固氮机理进入了更本质的研究阶段。

生物固氮是固氮微生物的一种特殊生理功能。自1886年拜叶林克（M.W.Beijerinck）分离得第一个固氮微生物（根瘤菌）以来，已发现并确证具有固氮能力的微生物有70多属，包括细菌、放线菌和蓝细菌（蓝藻），它们都是原核微生物。根据固氮微生物的特性和它们与其他生物的关系，通常将生物固氮作用分为三种类型。

自生固氮作用或自生固氮体系

各类自生固氮菌在土壤或培养基中生活时，可以固定分子态氮，对其他生物没有依存关系。

共生固氮作用或共生固氮体系

根瘤菌和豆科植物以及弗兰克氏放线菌和一些非豆科被子植物共生时，形成特定形态的共生结构（根瘤）进行固氮；蓝细菌和真菌共生形成一种特殊的植物体（地衣）进行固氮以及蓝细菌和苔藓植物（角苔）、水生蕨类植物（绿萍）、裸子植物（苏铁）、被子植物（根乃拉草）的共生固氮。在共生体系中固氮的微生物称为共生固氮微生物，但是它们并不一定只能在共生时固氮，已确证其中有些种类也能在实验室培养条件下表现不同程度的固氮能力，不过共生状态是它们在自然条件下发挥高效固氮作用所必需的。

是上述两者的中间类型，有些自生固氮菌如固氮螺菌（Azaspirillum）、雀稗固氮菌（Azotobacter paspali）能够生活在玉米、雀稗、水稻、甘蔗等植物根系的粘质鞘内或皮层细胞之间，形成联合固氮体系。它们与植物的共生关系有一定程度的专一性，但不形成特殊结构，而且都能营自生固氮。

不论哪种固氮体系的固氮微生物，分子态氮的还原都是固氮酶催化的，固氮酶的结构也极类似，都是由铁蛋白（AzoFd）和钼铁蛋白（MoFd）组成。铁蛋白是两个相同亚基的二聚体，分子量约为57～72×10³，含有一个[Fe₄S₄（Cys）₄]^n＋簇；钼铁蛋白是由两个大亚基和两个小亚基组成的α₂β₂型四聚体，分子量约为200～240×10³，含有两个铁钼辅因子（FeMo-Co），是催化作用的活性中心；还有4个[4Fe-4S]簇，称P中心。20世纪80年代还从需氧自生固氮菌（Azotobacter）细胞中发现了其他固氮酶体系，如由钒铁蛋白和蛋白组成的固氮酶。

固氮酶是一种多功能的氧化还原酶，能与许多具有三重键的分子发生反应，因此其底物与产物都具有多样性，除还原分子态氮为氨外，还能催化C₂H₂、H^＋、HCN、CH₃NC、N₃^-等的还原。固氮酶还原乙炔（C₂H₂）为乙烯（C₂H₄）的作用，被用来间接测定它的活性。它还是一个ATP酶，它能催化ATP→ADP＋Pi，并从中取得能量以活化N₂；又是一个氢化酶，但与一般氢化酶不同，不能催化的可逆反应，而只能催化单向依赖于ATP的放氢反应，这就消耗了活化N₂所需要的能量，从而影响固氮效率。H₂是固氮作用专一性的竞争性抑制剂，而固氮过程中H₂的形成是不可避免的。有些固氮菌具有吸氢酶，能催化H₂的氧化并释出电子，作为固氮作用的还原剂，进行氢的再循环，使释出能量生成ATP，这是能量的再利用。因此固氮酶催化的固氮作用和放氢之间的关系是较为复杂的。固氮酶进行催化作用必须同时具有两种酶蛋白组分、电子、质子（H^＋）、Mg^＋＋ATP，并在高还原势中进行。细胞内电子供体产生的电子经过起电子传递作用的载体（铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白），首先还原铁蛋白；被还原的铁蛋白再将电子转移给钼铁蛋白，使其还原；然后将电子转交给底物，完成整个催化过程。固氮酶的两个组分一旦分开、单独存在就失去固氮活性，必须结合在一起才具有固氮功能。从一种固氮菌细胞中分离到的一个组分，可以和其他固氮菌体中分离到的另一组分互补，组成具有功能的固氮酶，但来自同一种固氮菌体中的两个组分结合时，活性要高些。

生物固氮作用的总反应式如下：

生物固氮作用

由一分子N₂还原为两分子NH₃的过程中，电子的转移是多步骤的。固氮酶完成一个催化循环只转移一个电子，为完成8个电子的转移，一分子固氮酶必需经历8次催化循环；铁蛋白每转移一个电子也有两分子Mg^2＋ATP被水解；还有与固氮酶作用相联的放氢作用，不仅浪费还原力，也浪费了能量，所以固氮作用是一个大量耗能过程。由于氧（O₂）对固氮酶的钝化作用，固氮作用只能在防氧保护条件下进行。对专性嫌气固氮菌说来，其生活条件和固氮条件是一致的。好气固氮菌要在有氧条件下生活，与固氮所需条件相矛盾，不同类型的好气固氮菌各有其防氧保护机制，使其在有氧条件下固氮酶仍能正常进行催化作用，如好气自生固氮菌（Azotobacter）的“呼吸保护”和一些丝状蓝细菌的异形胞。氨是固氮作用的产物，但过多的外源铵态氮化合物的存在将抑制固氮作用，这时固氮菌利用化合态氮为氮源生长繁殖。氨既抑制固氮酶活性，也阻遏固氮酶的合成。

最早是用化学分析方法测定全氮量，将可能进行固氮的生物经纯培养后，测定其化合态氮总量有无增加，以鉴定固氮生物，此法既费时又不灵敏。20世纪40年代后期，采用了同位素¹⁵N示踪法，这一方法比化学分析法灵敏千倍，但设备要求高，操作繁复，使用上受到限制。60年代中期，创建了乙炔还原法，利用气相色谱仪间接测定固氮酶活性。它比同位素法更灵敏，灵敏度达10^-9克分子，对土壤中或植物根际范围内的固氮活性可进行原位测定，且设备简单，这是研究方法上最重要的突破。由于乙炔还原法检定的结果不一定与固氮酶活性呈直线相关，故¹⁵N示踪法仍用于严格的定量分析，两者常配合作双重检定。60年代以前，生物固氮研究限于细胞水平，在固氮微生物的整体细胞基础上检定固氮作用和探索固氮的代谢途径。1960年卡纳汉（J.E.Cama-ham）等用巴氏固氮梭菌（Clostridium pasteurianum）的非细胞提取液成功地实现了N₂还原成NH₃的试验，使固氮生化研究从整体细胞推进到非细胞水平。5年后，莫特森和布伦（L.E.Mortenson和W.A.Bulen）等分别从巴氏固氮梭菌和棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii）的细胞抽提液中分离出固氮酶的两个半纯化酶蛋白（钼铁蛋白和铁蛋白）。以后又从其他16种固氮菌细胞中分离得到结构相同的固氮酶，在一定条件下，它们都能催化分子态氮还原为氨。固氮酶的提纯标志着固氮的生化研究已进入分子水平，生物固氮机理的研究进入了更本质的阶段。20世纪后期，生物固氮研究进展迅速。乙炔还原法为测定固氮酶活性提供了迅速、灵敏的操作技术；固氮酶结构和固氮机理的探讨，推进了化学模拟固氮的研究；加上固氮基因的分析和初步转移成功，为改造原有固氮微生物种和杂交培育新种，以及从原核生物转移固氮基因至真核生物展现了前景。这三大研究成果为今后广泛深入研究生物固氮奠定了一定基础。几千年来，人类从事的农业生产，主要依靠生物固氮增加土壤中氮的含量，发展土壤肥力和提供农作物的氮营养。20世纪以来，工业上采用合成氨的方法提供化学氮肥，对农业生产起了明显的增产作用，但也带来了土壤性状劣化和环境污染的问题。同时合成氨是一个耗能大、成本高的工业，在当前能源短缺的情况下，其发展必然受到一定限制。据估计全球每年生物固氮量可达1.75亿吨分子态氮，超过工业固氮量三倍以上，并且目前还未能充分利用，生物固氮潜力巨大，这就使生物固氮的研究成为当前世界各国生物科学和农业科学研究领域以及化学工业生产中亟待解决的重大课题。